科研 南京中医药大学：二陈汤对Zucker糖尿病肥胖大鼠肠道菌群及脂质代谢紊乱的影响

  在这项研究中，我们首次发现ECD改变了ZDF大鼠肠道微生物群的组成和功能，从而使它们进入更健康的状态。

  肥胖是一种由遗传和外因引起的慢性代谢性疾病，已成为严重的全球健康问题。有证据说明，肠道微生物群与肥胖的发生和发展紧密关联。二陈汤(ECD)是一种传统的复方中药，近年来被大范围的应用于肥胖症及相关代谢性疾病的临床治疗和基础研究。它能显著改善胰岛素抵抗（IR）和脂质代谢紊乱。然而，还没有关于其代谢调节的微生物学研究。在这项研究中，我们研究了ECD对Zucker糖尿病肥胖（ZDF）大鼠的影响，特别是脂质代谢和肠道微生物群的组成和功能，并探讨了肠道微生物群的生物标记物与代谢物和宿主表型之间的相关性。根据结果得出，ECD能减轻体重，改善IR和脂质代谢，通过干扰ZDF大鼠胰岛素受体底物1（IRS1）/蛋白激酶B（AKT）/蛋白激酶A（PKA）/激素敏感型甘油三酯脂肪酶（HSL）信号通路，降低因过度脂解而从白色脂肪组织（WAT）释放的游离脂肪酸（FFA）浓度。此外，ECD通过降低ZDF大鼠肠道微生物群代谢产物丙酸的含量，逐渐调整了肠道微生物群的整体结构，逆转了六个属的相对丰度，并改变了肠道微生物群的功能。相关分析表明，生物标志物——特别是Prevotella,Blautia和Holdemania与丙酸和宿主表型之间有潜在的密切关系。根据结果得出，ECD对肥胖尤其是脂代谢紊乱的有益作用与ZDF大鼠肠道微生物群的调节有关。这为进一步研究ECD通过肠道微生物群改善肥胖的机制和临床应用提供了基础。

  适应性喂养后，将大鼠随机分为5组：对照组（L，n6）、模型组（Z，n8）、ECD低剂量组（EC-L，n8）、中剂量组（EC-M，n8）和高剂量组（EC-H，n8）。L组喂食正常饮食（MD17121，中国医学院），其他组喂食配方饲料（Purina#5008，美国实验室饮食）。膳食组成如补充表1所示。从5至9周龄开始，ECD治疗组（EC-L、EC-M和EC-H组）口服低（2.28 g/kg）、中（4.57 g/kg）或高（9.14 g/kg）剂量的ECD，L和Z组每天一次用高压消毒水代替ECD，体积为1 ml/100 g。这些剂量是根据动物和人类之间身体表面积的等效转换计算得出的。采用HE染色检测WAT细胞形态的差异。选取L、Z、EC组中最具代表性的4只大鼠进行Western Blotting和FFA测定。对5周龄和9周龄的L、Z和EC组大鼠粪便样本做16S rRNA基因测序。

  ECD样品的特征HPLC色谱图如图1所示。ECD包含四种化合物，甘草苷、橙皮苷、甘草酸和6-姜辣素，分别为类黄酮、皂甙和酚，这与先前研究的结果基本一致。UHPLC-ESIQ-TOF-MS总离子色谱图和ECD样品的结果如补充图1和补充表2所示。检测到126种正离子模式化合物和20种负离子模式化合物，包括HPLC未检测到的柚皮苷和8-姜辣素。在正离子模式下发现了槲皮素，在正离子和负离子模式下都发现了五种化合物。先前的研究预测橙皮苷、柚皮苷、金钱草素、甘草酸和6-姜辣素可能是ECD干预代谢疾病的主要生物活性成分和药物基础。

  图1 ECD的化学成分。（A）混合标准品和（B）ECD样品的HPLC色谱图。（C） ECD样品中四种组分的化学结构。1）每个图中的甘草苷、2）柚皮苷、3）橙皮苷、4）甘草酸、5）6-姜辣素、6）8-姜辣素、7）10-姜辣素。

  为了观察ECD对ZDF大鼠肥胖的影响，我们比较了五组大鼠的体重、腹围和食物摄入的变化。结果显示，与L组相比，Z组的体重年龄差异依赖性增加。ECD治疗可明显降低8周龄大鼠的体重。在9周龄时，与ECD治疗组的基线相比，ECD治疗组的体重增加明显低于Z组（图2A，B）。每周腹围的变化趋势与体重的变化趋势相同，7周龄的ECD治疗明显降低了增大的腹围（图2C），这表明ECD对腹部肥胖有干预作用。然而，ECD的干预效果并不是通过控制食物摄入来实现的（图2D）。

  在9周龄时通过ITT评估胰岛素敏感性。结果显示，Z组每个时间点的血糖水平和AUC都较高，而ECD治疗有效地提高了胰岛素敏感性（图2E，F）。此外，Z组的空腹血清胰岛素水平和HOMA-IR指数非常明显升高，而ECD治疗减弱了ZDF大鼠的IR（图2G，H）。

  实验结束时，对脂肪体比率和血脂进行标准化。根据结果得出，Z组大鼠脂体比和各项血脂指标明显升高。ECD明显降低附睾和总脂肪体比率、血清LDL-C和TG（图2I，J），表明ECD可调节体内异常脂质代谢。这一些数据表明，ECD可以有效地预防和治疗ZDF大鼠的肥胖，并如预期的那样改善IR和脂质代谢紊乱。

  EC-M组使用的剂量为临床有效剂量，与EC-H组相比，其作用基本相同，但对大鼠肝肾功能的负面影响较小（主要体现为EC-H组ALT非常明显升高，Cr水平更显著升高，如补充图2所示）。因此，以EC-M为治疗组代表进行后续研究。

  图2 ECD延缓了ZDF大鼠肥胖的发展。（A）每周体重变化。（B） 9周龄时体重增加。（C）每周腹围变化。（D）每周食物摄取量的变化。（E）ITT期间的血糖水平。（F）AUC基于ITT数据。（G）空腹血清胰岛素水平。（H）HOMA-IR指数。（I）肾周、附睾和总脂肪体比率。（J）9周龄时血清TC、HDL-C、LDL-C和TG水平。数据表示为平均值±SEM（n 5 8. Zvs. L，**p0.01，***p0.001，****p0.0001；EC-L、EC-M和EC-H与Z组的比较，#p0.05、##p0.01、###p0.001、####p0.0001）。（A）（C）、（D）和（E）采用双因素方差分析，其余采用单因素方差分析。

  WAT储存TG作为能量储备，并以FFA的形式向组织提供能量。在病理条件下，过度脂肪分解是肥胖的特征性病理改变。在组织学水平，HE染色结果为，L组脂肪细胞大小均匀，边界清晰，排列紧密。然而，在同一视野中，Z组的脂肪细胞数量减少，脂肪细胞的直径和横截面积增加，而ECD治疗增加了脂肪细胞的数量，减少了脂肪细胞的面积，使其趋于正常（图3A，B）。胰岛素对脂肪分解有重要的调节作用。它通过结合脂肪细胞上的受体激活胰岛素信号，并调节下游PKA活性。HSL是二酰甘油水解为甘油和FFA过程中的关键酶，是PKA控制的重要靶点。通过western blotting检测ZDF大鼠附睾WAT中p-IRS1/IRS1、p-AKT/AKT、p-PKA/PKA和p-HSL/HSL的表达，以探讨ECD对脂肪分解的潜在影响。根据结果得出，三组中IRS1、AKT、PKA或HSL的总蛋白水平没有显著变化。然而，我们观察到Z组的磷酸化差异，p-IRS1/IRS1、p-PKA/PKA和p-HSL/HSL水平非常明显升高，p-AKT/AKT水平下调。与Z组相比，ECD可以反方向调节这些分子的磷酸化状态，从而明显提高活性。ATGL是一种限速酶，可将三酰甘油分解为二酰甘油，二酰甘油为HSL提供底物。与HSL相反，其活性似乎不受磷酸化的调节。因此，我们还检测了ATGL蛋白的表达。与L组相比，Z组的ATGL蛋白含量明显降低，但ECD并未对其进行修饰。这些根据结果得出，ZDF大鼠的WAT中有几率存在异常脂肪分解，ECD对脂肪分解的影响更多地依赖于IRS1/AKT/PKA/HSL信号通路的改善，而不是HSL或ATGL的直接调节（图3C，D）。胰岛素对ATGL的调节不是由AKT或PKA介导的，这可以解释为什么ECD对ATGL没有影响。脂肪分解水平影响循环中FFA的含量。因此，我们比较了三组大鼠的空腹血清FFA浓度，以证实ECD对ZDF大鼠脂肪分解功能的影响。与L组相比，Z组的FFA浓度增加，而ECD治疗明显降低了ZDF大鼠的FFA浓度（图3E）。上述根据结果得出，ZDF大鼠WAT存在细胞形态异常和过度脂解，ECD可通过干扰胰岛素信号转导，对脂肪细胞形态具有保护作用，减少WAT过度脂解引起的FFA释放，这可能与IRS1/AKT/PKA/HSL信号通路的改善有关。

  探讨ECD的生物学效应是否与肠道微生物群的变化有关，肠道微生物群是肥胖发展的重要靶点，我们收集了5周龄和9周龄大鼠的粪便样本，并使用Illumina高通量测序平台对肠道微生物群的16S-V3V4区域进行双端测序。在去噪后总共收集了1610611个序列，对44个样本做质量控制后获得了1113709个高质量序列。每个样本的17692序列丰度确保了所有样本在水平调整后在相同的测序深度水平上进行分析。

  我们进一步观察了大鼠肠道微生物群组成的变化。我们得知，从5到9周龄，L组和Z组之间的共享ASV从890减少到312，Z组和EC组之间的共享ASV从1237减少到689（图4C），这表明肥胖的发展和ECD的干预都可能会引起大鼠肠道微生物群的组成发生一些变化。图4D、E分别显示了5周龄和9周龄各组大鼠粪便微生物群相对丰度最高的10个门和15个属。厚壁菌门和拟杆菌门是两个主要门，其次是变形菌和放线菌，这与人类肠道微生物群的情况相似。在属水平上，乳酸杆菌是各组大鼠所有阶段的优势属。在两个阶段对各组肠道微生物群前10个丰富属的层次聚类分析表明，EC组的微生物组成在5周龄时与Z组相似，而在9周龄时，由于ECD的干预，EC组的微生物组成与L组更为相似（图4F）。这些根据结果得出，ECD逐渐调节ZDF大鼠肠道微生物群的整体结构和属组成。

  图4 ECD调节了ZDF大鼠肠道微生物群的整体结构和组成。5周龄和9周龄时各组的肠道微生物群。（A）辛普森多样性。Kruskal-Wallis秩和检验和Dunnett’s检验被用作事后检验，以验证差异的显著性*p0.05，**p0.01。（B）基于未加权UniFrac距离的PCoA，置信度为0.95。（C）ASV-Venn图。（D、 E）门和属水平的肠道微生物群组成。（F）属级层次聚类分析。左面板是一个层次聚类树图，右面板是一个总属的堆叠柱状图。

  为了在属水平上检测生物标记物，我们在5周龄和9周龄时水平比较了三组的肠道菌群组成，并在垂直方向上比较了各组在5至9周龄时肠道菌群的变化。随着肥胖症的发展，肠道微生物群发生了显著变化，并对ECD治疗进行了探讨。我们得知在5周龄时，肠道菌群在属水平上的差异不显著。然而，从5到9周，在肥胖症的发展过程中，9个属（Prevotella, Blautia, Dorea, SMB53,Allobaculum, Coprobacillus, [Ruminococcus], Holdemania和Sutterella）增加,5个属（Akkermansia,Oscillospira, Adlercreutzia, Dehalobacterium和f_Erysipelotrichaceae_g_Clostridium）减少，在9周龄时，Z组与L组相比有显著差异，这在某种程度上预示着这些属与肥胖进展的潜在相关性（补充表3）。同时，ECD处理逐渐改变了上述四个属的相对丰度，包括Prevotella, Blautia, Coprobacillus和Holdemania的相对丰度减少，以及Akkermansia的相对丰度增加。此外，ECD也慢慢地减少了Ruminococcus的数量。在9周龄时，EC组中这些属的相对丰度明显不同于Z组，并趋于正常水平，这是ECD的细菌靶标。LDA值分布直方图和相应的分支图用于显示9周龄时各组之间有显著差异的微生物群及其分类层次（图5A、B）。ECD干预生物标志物的相对丰度如图5C所示，其LDA和p值如补充表4所示。这些属的重要性顺序如随机森林分析所示。特别是，Prevotella,Ruminococcus, Blautia和Holdemania对组间差异的形成有更大的影响（图5D）。

  图5 ECD在ZDF大鼠肠道菌群属水平上调节生物标志物的丰度。三组均为9周龄。（A）L组和Z组生物标志物的LDA值分布直方图和分支图。（B）Z组和EC组生物标志物的LDA值分布直方图和分支图。（C）三组Prevotella，Blautia，Ruminococcus，Holdemania，Coprobacillus和Akkermansia的相对丰度。p值由LEfSe分析确定。（D）随机森林分析肠道微生物区系差异。颜色的强度代表各样品中肠道菌群的丰度分布（红色表示对应丰度较高；蓝色，对应的丰度较低）。

  为了观察肠道微生物群组成的变化是否进一步导致功能变化，我们进一步进行了微生物群功能的预测，并检测了重要微生物群代谢产物SCFA含量的变化。9周龄大鼠肠道微生物群的功能主要集中于遗传信息处理和代谢，尤其是能量代谢和三种主要能量物质：氨基酸、碳水化合物和脂质的代谢（图6A）。然而，PCoA显示三组大鼠的微生物功能存在一定的分离。在PC1维度，EC组的功能组成与L组更为相似，贡献率为51%（图6B）。八种信号通路存在非常明显差异，包括胰岛素信号通路（ko04910）（图6C）。其丰度与Prevotella, Blautia, Ruminococcus, Holdemania和Coprobacillus的相对丰度显著正相关（图6D），这意味着这些ECD干预生物标记物具有潜在作用。肠道微生物群分泌、修饰和降解的代谢产物是宿主微生物群对话的重要介质，参与宿主代谢的调节。SCFA是盲肠中高浓度的代谢产物，主要包括乙酸、丙酸和丁酸。9周龄各组盲肠中SCFA的代谢情况结果表明，ZDF和ZL大鼠在SCFA的组成上是分离的（图6E）。与L组相比，Z组五种SCFA的含量有显著变化，其中丙酸、丁酸和异戊酸显著增加，而异丁酸和3-羟基异戊酸显著减少。ECD治疗显著降低了丙酸，并倾向于降低丁酸和异戊酸，同时提高大鼠盲肠中的异丁酸和3-羟基异戊酸（图6F）。据报道，Prevotella、Blautia和Ruminocococus菌株通过发酵产生丙酸。因此，ECD可能会减少这些细菌的数量，从而降低丙酸的含量。醋酸是大多数肠道细菌的发酵产物。丁酸和丙酸产生菌几乎是不同的，这解释了为什么各组之间乙酸含量没有差异，或者干预后丁酸含量有显著变化。

  ECD显著改善IR和脂质代谢紊乱，尤其是ZDF大鼠的WAT。因此，我们分析了六个核心属和丙酸（在ECD干预后发生变化）与宿主表型之间的相关性（图6G）。我们观察到，Prevotella和Blautia不仅与体重和腹围等肥胖表型显著正相关，还与IR和脂质代谢异常等病理表现显著正相关，而Holdermania主要与脂质代谢紊乱相关指标正相关。Prevotella、Blautia、Ruminocococus、Holdemania和Coprobacillus也与WAT中IRS1/AKT/PKA/HSL信号通路的表达表现出不同程度的相关性。此外，肠道微生物代谢物丙酸的含量与体重、腹围和与脂质代谢紊乱相关的表型显著正相关。这些结果揭示了宿主表型与生物标记物之间的潜在密切关系，尤其是Prevotella, Blautia,Holdemania和丙酸。这些可能是ECD改善肥胖的重要目标，尤其是通过肠道微生物群改善脂质代谢紊乱。胰岛素信号通路的调节也可能发挥重要作用。

  图6 ECD调节ZDF大鼠肠道微生物群的功能。三组均为9周龄。（A）肠道微生物群落二级分类水平上KEGG功能途径的丰度。（B）基于Bray-Curtis相似性的肠道微生物群功能单位PCoA。置信度为0.95。（C）肠道微生物群的不同代谢途径。颜色的强度代表每个样本中肠道微生物群和信号通路之间的关联程度（红色，强相关性；蓝色，低相关性）。（D）Prevotella，Blautia，Ruminocococus，Holdemania，Coprobacillus，Akkermansia与胰岛素信号通路（ko04910）之间的相关性分析。（E） SCFAs的二维和三维PLS-DA。（F）盲肠内容物中丙酸、丁酸、异戊酸、异丁酸和3-羟基异戊酸的含量。采用单因素方差分析（Z vs. L，*p0.05，**p0.01，***p0.001；EC vs. Z，p0.05）。（G）微生物和SCFA生物标记物与宿主表型之间的相关性。该小组展示了六个不同属和丙酸与肥胖、IR和脂质代谢紊乱表型以及IRS1/AKT/PKA/HSL信号通路表达的相关性。颜色强度表示关联程度（红色，正相关；蓝色，负相关）*p0.05，**p0.01，***p0.001，****p0.0001。

  在这项研究中，我们首次发现ECD改变了ZDF大鼠肠道微生物群的组成和功能，从而使它们进入更健康的状态。有趣的是，ECD干预引起的肠道菌群变化与IR和脂质代谢紊乱的改善密切相关，尤其是在WAT中，这表明ECD对肥胖，尤其是脂质代谢紊乱的有益作用与ZDF大鼠肠道菌群的调节有关。

  由于瘦素受体细胞外区域的突变，ZDF大鼠以肥胖、IR和高脂血症为特征。与传统饮食模型相比，该动物模型时间间隔短，稳定性好，是研究肥胖的理想动物模型。我们发现，ECD治疗有助于减轻肥胖的负面影响，包括减轻体重、改善IR和调节血脂异常，这与之前的研究一致，并说明了ECD对遗传因素引起的肥胖具有调节作用。然而，ECD对血脂中TC和HDL-C的调节作用目前并不一致，这可能与不同的模型和药物浓度有关。

  以前的研究已经调查了ECD调节代谢的生物学效应。ECD可以促进CDKAL1的表达，改善胰岛细胞的功能，从而改善胰岛素分泌。此外，ECD改善脂质代谢的干预效应包括炎症反应和脂质转运。脂质代谢平衡是脂肪生成和脂肪分解相结合的结果。研究发现，ECD上调内脏脂肪和骨骼肌中过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARγ）和骨骼肌中脂蛋白脂肪酶（LPL）的表达，通过抑制肝脏中IRS1磷酸化的表达，减少IR引起的脂质积聚。脂肪组织是治疗肥胖的重要靶器官，因为它在肥胖个体中扩张。由于体内平衡调节和持续的低水平炎症，过量脂肪会导致脂肪分解，导致FFA释放到循环和肝脏、骨骼肌、胰腺和其他组织，从而导致全身脂质毒性和IR。特别是，内脏脂肪细胞肥大导致胰岛素敏感性降低，胰岛素抗脂解作用减弱，脂肪细胞的脂解活性增强。研究发现，胰岛素的抗脂解作用可通过AKT/PKA/HSL信号通路进行调节，抑制脂肪组织的过度脂解是治疗代谢性疾病的重要途径。与之前的结果一致，我们发现ZDF大鼠的WAT中脂肪细胞扩张，IRS1磷酸化增加，AKT活性降低，胰岛素信号转导受损，而PKA介导的HSL活性上调，释放FFA进入循环的能力增强。ECD不仅改变了WAT的组织学形态，而且通过调节IRS1/AKT/PKA/HSL信号通路并使其恢复正常，改善了WAT的脂肪分解。在摄食量和热量基本相同的情况下，ECD改变了ZDF大鼠的体重，这可能与能量消耗增加有关。之前的研究和我们的研究都表明，ECD可以改善脂肪组织的代谢调节，这可能伴随着脂肪组织中线粒体功能的改变，因为位置和活性的改变，脂肪组织中线粒体的功能在脂质代谢的稳态中发挥关键作用。

  宿主遗传学影响肠道微生物群的组成，肠道微生物群反过来调节宿主的能量稳态和糖脂代谢。此外，环境因素也对肠道微生物群产生重要影响。许多研究表明，肠道微生物群的变化与肥胖的发生和发展之间存在着密切的潜在联系。靶向肠道微生物群可以提高胰岛素敏感性，从而调节脂肪细胞中胰岛素介导的脂质代谢并改善宿主肥胖。在我们之前的研究中，我们观察了粪便微生物群移植对肥胖易感糖尿病进展的影响和ZDF大鼠糖尿病期粪便微生物群的动态变化，揭示了肠道微生物结构和组成在ZDF大鼠疾病进展中的潜在作用。同时，我们发现中药配方ECD可以延缓ZDF大鼠肥胖的发展。在此基础上，我们研究了ECD对ZDF大鼠肥胖期肠道微生物群的干预作用。我们发现，在肥胖的发展过程中，ECD逆转了变化的多样性，调整了整体结构，并在属水平上改变了肠道微生物群的组成，使其正常，特别是在ZDF大鼠中，Prevotella, Blautia, Ruminococcus,Holdemania, Coprobacillus和Akkermansia的相对丰度。目前的研究表明，Prevotella和Blautia与宿主健康或疾病状态的关系存在争议。一些研究人员认为，增加Prevotella的丰度可以促进糖原储存，并产生琥珀酸来激活肠糖异生，这与改善糖代谢和胰岛素耐受有关。然而，一些研究发现，Prevotella可参与支链氨基酸的生物合成，这是胰岛素敏感性降低、糖耐量降低和2型糖尿病发生的重要风险因素。此外，高水平的Prevotella可以激活免疫细胞和基质细胞，释放更多的炎症介质，促进慢性炎症，并参与疾病过程。肥胖和非酒精性脂肪肝个体中，Prevotella显著富集。我们发现，ECD干预降低了ZDF大鼠中普雷沃特菌的升高，除胰岛素抵抗外，Prevotella的丰度与脂质代谢紊乱显著正相关，而之前的研究主要集中在碳水化合物和氨基酸代谢途径上。Blautia是一种重要的SCFA产生菌，具有抗炎作用，有助于恢复肠粘膜损伤；它与内脏脂肪含量呈负相关，并在代谢紊乱中发挥有益的治疗作用。然而，一些研究表明，较高的Blautia与肠道通透性增加有关，其丰度与代谢疾病呈正相关，并与血浆谷氨酸和支链氨基酸等心血管疾病预测因子相关。代谢性疾病，如肥胖、糖尿病和非酒精性脂肪性肝炎中Blautia的丰度增加。这可能与其他产生SCFA的细菌数量减少有关，也可能与不同疾病阶段的炎症反应有关。我们的结果表明，ECD减少了Blautia，该物质在ZDF大鼠体内显著富集，其丰度与胰岛素敏感性和脂质代谢的负面影响显著正相关。Ruminococcus可降解抗性淀粉，从而增加肠道能量吸收，从而促进个体体重增加。它还通过促进氧化应激和炎症反应影响肠道健康；并被认为与人类健康的负面后果有关。ECD降低了该属的相对丰度。Erysipelotrichaceae的成员与糖和脂代谢受损的临床指标密切相关，是代谢性疾病的重要目标。Holdemania和Coprobacillus都是Erysipelotrichaceae的成员。Holdermania与炎症反应的发生有关，在1型糖尿病患者中升高，并被认为是高血压的预测因子。Coprobacillus是一种重要的丁酸产生菌，可与Anaerostipes, Roseburia和Bifidobacterium交叉喂养，以维持结肠中的丁酸浓度。它通过炎症反应影响肠道功能并介导相关肠道疾病，其丰度也与免疫功能相关基因的表达呈正相关；通过脂质代谢的影响，其在肥胖动物和人类肠道中的丰度增加。ECD有效地降低了ZDF大鼠中这两个Erysipelotrichaceae的相对丰度，我们发现Holdermania的相对丰度与异常脂质代谢显著正相关。Akkermansia是目前研究最广泛的益生菌之一，可能适合治疗代谢综合征。它可以改善肥胖动物和人类的代谢紊乱，包括胰岛素敏感性降低和糖脂代谢紊乱。它通过细胞膜蛋白AMUC-1100与toll样受体2结合的免疫调节作用恢复肠屏障功能，减少巨噬细胞浸润、促炎细胞因子和趋化因子表达，从而降低心血管疾病的风险。ECD增加了Akkermansia的相对丰度，而ZDF大鼠的Akkermansia相对丰度降低。当前研究结果的不一致性不仅与疾病状态、动物模型、干预措施、饮食等方面的差异有关，还表明微生物群的影响不能简单地概括为有益或有害。物种水平的差异可能导致不同的结果，疾病表型通常只与少数菌株相关。因此，有必要在今后的研究中进一步探讨每个属下特定菌株的变化。

  肠道微生物群是调节WAT褐变和棕色脂肪组织活动的一个重要内源性因素，它可以调节WAT炎症并影响WAT功能。研究表明，肥胖个体的肠道屏障损伤可导致肠道菌群或菌群成分移位，脂肪组织中的细菌数量与免疫细胞浸润、炎症和代谢指标有关，影响肥胖个体的代谢健康。肥胖相关有害菌株的治疗增加了肥胖小鼠脂肪细胞的肥大，导致胰岛素敏感性降低和脂肪组织中脂解增加。我们发现Prevotella，Blautia和Holdemania的相对丰度不仅与宿主表型显著正相关，还与WAT中IRS1/AKT/PKA/HSL信号通路的表达显著正相关，表明Prevotella，Blautia和Holdemania可能是ECD增强胰岛素敏感性的重要靶点，从而减少ZDF大鼠WAT的过度脂解。但具体机制尚不清楚，这是今后值得关注的研究方向。

  这项研究是首次检测ECD干预的肠道微生物群目标。除肠道微生物群外，其代谢产物SCFA可能是发挥其代谢作用的重要途径。尽管SCFA与代谢有关，但目前SCFA在能量稳态中的作用尚不明确。一些动物和人类研究表明，肥胖与高水平的SCFA有关。肠道微生物群在小肠内发酵未消化的碳水化合物（如抗性淀粉和膳食纤维）和蛋白质，产生SCFA，增加能量吸收，然后在全身从头合成脂质和葡萄糖，提供个人能量需求的10%左右，可能导致肥胖。一直以来，9周龄ZDF大鼠盲肠内容物中两种最重要的SCFA丙酸和丁酸显著增加。这种变化可能是ZDF大鼠肠道内产生这两种SCFA的细菌增多或利用它们的细菌减少的结果。这些变化也可能与不同肠道微生物群的发酵或利用率、微生物交叉喂养、粘膜吸收和转运率以及其他复杂因素有关。研究表明，丁酸是肠上皮细胞的主要能量来源，可增加脂质合成。粪便中存在丙酸与2型糖尿病风险增加有关。此外，丙酸和丁酸均可刺激脂肪细胞的脂肪分解。我们发现丙酸含量与肥胖和脂质代谢紊乱的表型显著正相关。丙酸含量降低可作为胰岛素敏感性改善的独立预测因子。ECD给药降低了ZDF大鼠体内丙酸的浓度，可能是通过调整肠道微生物群来改变发酵产物的含量。研究表明，Blautia菌株通过丙二醇途径发酵脱氧糖鼠李糖和岩藻糖形成丙酸。Prevotella和Ruminocococus通过琥珀酸途径产生琥珀酸，这是丙酸的中间产物。因此，丙酸可能是ECD干预肠道微生物群的重要介质，也是未来研究的课题。不同的SCFA可能通过协同作用和拮抗作用发挥其生物学效应。此外，不同肠段中的SCFA含量不同，循环中的SCFA与外周胰岛素敏感性、全身脂肪分解和代谢健康更密切相关。因此，ECD对SCFA的调节作用仍需进一步探讨。

  综上所述，我们发现ECD可以调节ZDF大鼠的脂质代谢，改善WAT中的脂肪分解，并调节肠道微生物群的组成和功能。生物标记物与宿主表型之间存在非常明显相关性，表明ECD对肥胖，尤其是脂质代谢紊乱的有益作用与肠道微生物群的调节有关。本研究的局限性在于，首先，异氟醚麻醉可能会加重先前存在的IR，从而影响ZDF大鼠IR程度的判断。其次，可能需要从基因水平和更多的分子实验来证实WAT的脂解功能变化所引起的分子间复杂的串扰。此外，饮食因素也不容忽视。ZL和ZDF大鼠的饮食成分不同（补充表1），ZDF大鼠的食物摄入量远高于ZL大鼠（图2D），这导致肠道微生物群发酵的底物类型和数量不同，导致代谢差异。最后，ECD调节肠道微生物群与改善脂质代谢之间的因果关系有待进一步探讨。

  我们得知，ECD通过提高ZDF大鼠WAT中IRS1/AKT/PKA/HSL信号通路的活性，延缓肥胖的发展，抑制过度脂肪分解。此外，ECD对肥胖相关肠道微生物群的组成和功能有影响，降低了Prevotella,Blautia和Holdemania以及代谢物丙酸的含量。这些生物标志物与宿主肥胖表型，尤其是脂质代谢紊乱显著正相关。本研究为ECD通过肠道微生物群改善肥胖和调节脂质代谢紊乱的作用提供了新的见解，并有助于进一步阐明ECD治疗肥胖的机制。

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